SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
PRÁCTICA No.2.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES.
QUE PRESENTAN:
CARMEN MONDRAGON ÁNGEL. 08930110
HILARIO CASTAÑEDA SEVERIANO. 08930118
JAIMES YAÑEZ NEREO. 08930120
MEDRANO ALONZO AGUSTÍN. 08930122
VILLA LOPEZ ERISAEL. 08930298
LICENCIATURA EN BIOLOGIA
VIII SEMESTRE
Ciudad Altamirano, Gro. México. Febrero del 20
RESUMEN
En la preparación de soluciones madres es con la finalidad de tener el conocimiento de los diferentes componentes que existen en los medios de cultivo, para poder preparar estas soluciones es necesario saber que tipo de compuestos se van a agregar, en ocasiones se requieren concentraciones muy bajas de alguno de ellos, por lo que es necesario preparar soluciones a una elevada concentración y a partir de esta diluirla hasta la concentración requerida. Así mismo como el uso adecuado de las diferentes técnicas y los reactivos para saber la función nutricional de cada una de estos medios de cultivo. Al preparar los reactivos sulfato-férrico y EDTA estos son aforados con agua destilada a 200ml, posteriormente son agregados a una botella color ámbar y al refrigerador a 4º c.
SUMMARY
in the preparation of stock solution is in order to have knowledge of the different components that exist in the culture media in order to prepare these solutions is necessary to know what type of compounds to be added, sometimes require very low concentrations any of them, making it necessary to prepare highly concentrated solutions and from this dilution to the required concentration. Likewise the appropriate use of different techniques reagents to know the nutritional role of each of these culture media. In preparing reagents ferric sulfate and EDTA these are graduated to 200 ml whit distilled water, are then added an amber bottle and refrigerated at 4º c.
INDICÉ
I. ANTESEDENTES**********************************************************4-7
II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA*********************************************8
III. OBJETIVO (S)****************************************************************9
IV. JUSTIFICACION************************************************************10
V. FUNDAMENTÓ TEÓRICO*********************************************11-12
VI. MATERIALES Y MÉTODOS*******************************************13-14
VII. RESULTADOS**********************************************************15-16
VIII. CONCLUCIONES Y RECOMENDACIONES*****************************17
IX. FUENTES CONSULTADAS***********************************************18
X. ANEXOS*********************************************************************19
I. ANTESEDENTES
CULTIVO IN VITRO: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE (MURASHIGE & SKOOG 1962)
Las soluciones deben prepararse con mucho cuidado y precisión. Las sales deben pesarse en una balanza granataria (precisión= 0.01 g) y en la balanza analítica se pesaran las vitaminas y reguladores de crecimiento (precisión = 0.0001 g). La conservación de las soluciones madres se hará de 4-5 C. en el refrigerador, es recomendable no prolongar por mas de tres meses la conservación de las soluciones madres de sales minerales. Las que contengan vitaminas y sustancias de crecimiento estables podrán conservarse un máximo de 4 semanas.
1.1 MACRONUTRIENTES
Se prepara el material de vidrio a utilizar (Erlenmeyer de 1 L., pipetas de varios tamaños), estos deben estar esterilizados, y secos. Se preparan los otros materiales a utilizarse (papel de aluminio cortado, piseta, balanza analítica, reactivos, espátula).
Se enciende la balanza analítica. Se coloca un cuadrado de papel aluminio y se encera la balanza. Una vez que la balanza esta en “0”, se procede a pesar el reactivo. Cuando se tiene el peso deseado se retira el mismo en el papel aluminio en el cual se peso y se lo reserva, hasta, terminar de pesar todos. Una vez que se ha terminado de pesar todos, se procede a preparar la solución de macro nutrientes.
Primeramente se lava el Erlenmeyer con agua destilada y se coloca un poco de agua destilada, aproximadamente 100 ml.
Se agrega los reactivos uno a uno, siempre limpiando el papel aluminio con la Piseta, para asegurar que no quede nada pegado en el mismo. Cuando se han agregado todos los reactivos, se enraza con agua destilada hasta completar 1 L. y con un pedazo de papel de aluminio se tapa el Erlenmeyer y se procede a mezclar; se puede utilizar un agitador magnético.
1.2. MICRONUTRIENTES
Se prepara el material de vidrio a utilizar (Erlenmeyer de 1 L., pipetas de varios tamaños), estos deben estar esterilizados, y secos. Se preparan los otros materiales a utilizarse (papel de aluminio cortado, piseta, balanza analítica, reactivos, espátula).
Se enciende la balanza analítica. Se coloca un cuadrado de papel aluminio y se encera la balanza. Una vez que la balanza esta en “0”, se procede a pesar el reactivo. Cuando se tiene el peso requerido se retira el mismo en el papel aluminio en el cual se peso y se lo reserva, hasta, terminar de pesar todos. Es importante que en los reactivos para la solución de micronutrientes se pese el valor requerido, porque con solo 1 miligramo de mas, o de menos, puede alterar el resultado final. Una vez que se ha terminado de pesar todos, se procede a preparar la solución de micronutrientes.
Primeramente se lava el Erlenmeyer con agua destilada y se coloca un poco de agua destilada. Se agrega los reactivos uno a uno, siempre limpiando el papel aluminio con la Piseta, para asegurar que no quede nada pegado en el mismo.
Cuando se han agregado todos los reactivos, se enraza con agua destilada hasta completar 200 ml. Con un pedazo de papel de aluminio se tapa el Erlenmeyer y se procede a mezclar; se puede utilizar un agitador magnético.
1.3. QUELATO DE HIERRO
Se prepara el material de vidrio a utilizar (Erlenmeyer, agitador, rejilla de asbesto), estos deben estar esterilizados, y secos. Se preparan los otros materiales a utilizarse (papel de aluminio cortado, piseta, balanza analítica, reactivos, espátula).
Se enciende la balanza analítica. Se coloca un cuadrado de papel aluminio y se encera la balanza. Una vez que la balanza esta en “0”, se procede a pesar el reactivo. Cuando se tiene el peso requerido se retira el mismo en el papel aluminio en el cual se peso y se lo reserva, hasta, terminar de pesar todos.
En un Erlenmeyer se coloca el agua y el EDT y se lo lleva al fuego sobre una rejilla de asbesto. Cuando ha hervido se le adiciona el sulfato de hierro . Cuando vuelve a hervir se retira del fuego se deja enfriar. Se enrraza a 100 ml y se coloca en un envase color Ámbar para evitar la degradación de los componentes.
1.4. VITAMINAS.
Se prepara el material de vidrio a utilizar (Erlenmeyer de 100 mL., pipetas de varios tamaños), estos deben estar esterilizados, y secos. Se preparan los otros materiales a utilizarse (papel de aluminio cortado, piseta, balanza analítica, reactivos, espátula).
Se enciende la balanza analítica. Se coloca un cuadrado de papel aluminio y se encera la balanza. Una vez que la balanza esta en “0”, se procede a pesar el reactivo. Cuando se tiene el peso deseado se retira el mismo en el papel aluminio en el cual se peso y se lo reserva, hasta, terminar de pesar todos. Una vez que se ha terminado de pesar todos, se procede a preparar la solución de macro nutrientes.
Primeramente se lava el Erlenmeyer con agua destilada y se coloca un poco de agua destilada. Se agrega los reactivos uno a uno, siempre limpiando el papel aluminio con la Piseta, para asegurar que no quede nada pegado en el mismo. Cuando se han agregado todos los reactivos, se enraza con agua destilada hasta completar 200 ml. y con un pedazo de papel de aluminio se tapa el Erlenmeyer y se procede a mezclar; se puede utilizar un agitador magnético.
1.5. HORMONAS.
Las Auxinas y Giberelinas se disuelven con alcohol antiséptico (70º)
G3 10MG / ALCOHOL 5ML + AGUA DESTILADA 5 ML
ANA 12 MG / ALCOHOL 3 ML + AGUA DESTILADA 9 ML.
AIA 13 MG / ALCOHOL 5 ML + AGUA DESTILADA 8 ML.
Las Citocininas se disuelven con clorhídrico
BAP 10 MG…..HIDROXIDO 4 ML + AGUA DESTILADA 6 ML
Una vez preparadas las hormonas se las mantiene en congelación y al momento de utilizarlas se las calienta sobre una rejilla de asbesto las que se han congelado.
II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Debido al elevado número de compuestos que incluye la formulación de las sales minerales que se emplea para un medio en particular (ej. Murashige y Skoog (MS, 1962)). Y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentración, resulta más práctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace más rápida la futura preparación de medios y minimiza los errores (debidos a las numerosas pesadas de cantidades muy pequeñas).
III.OBJETIVO(S)
3.1. Objetivo(s) generales
- En esta practica realizaremos la preparación de las soluciones madre, patrón o estándar.
3.2 Objetivos específicos
-conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza química y bioquímica.
-manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.
-comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.
IV. JUSTIFICACION
Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión.
Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos en un frigorífico de 4 estrellas.
V. FUNDAMENTO TEORICO
Un medio de cultivo consiste en un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de células vegetales. Según que se quiera hacer crecer el medio requiere unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado solido, semisólido y liquido. El objetivo último del medio es variado: antibiograma, identificación, multiplicación.
5.1 CLASIFICACIÓN:
5.1.1 SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).
1) Medios líquidos: se denominan por esta razón caldos.
2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos.
3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos.
Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.
2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida.
3) Medios semisintéticos: En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo.
a) naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal, como extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
b) sintéticos: son los medios que contienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente.
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente práctica se realizo en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico De Ciudad Altamirano
Primeramente se realizaron las soluciones stock, para ello se prepararon los componentes que formarían dicha solución en nuestro caso a nuestro equipo nos tocaron los quelatos que están compuestos por Fe SO4 7H2O y EDTA 2H2O tomando en cuenta que sería una concentración de 100x y un volumen de 200ml.
Fe SO4 7H2O = 0.0278
0.0278g x 100x 200ml/100ml = 0.556g
EDTA 2H2O = 0.0372
0.0372g X 100 X 200ml/200ml = 0.744g
Como siguiente paso pesamos los componentes (cabe mencionar que se peso exactamente los gramos que salieron después de las operaciones realizas en las cuales se tomo la concentración y el volumen en q se realizaron las disoluciones).
Fe SO4 7H2O = 0.0278
EDTA 2H2O = 0.0372
Seguidamente se disolvieron en agua con un volumen inicial de 50 ml de agua destilada en cada vaso de precipitado, esto para evitar que se rebasara el volumen permitido.
El Fe SO4 7H2O se disolvió en 50 ml de agua destilada y el Fe SO4 7H2O en 50 ml de agua destilada calentando un poco a baño de María, esto para q el 2H2O se disolviera perfectamente, y se dejo enfriar por unos minutos.
Después se mezclaron las dos soluciones y se agitan bien. Se completa con agua destilada hasta tener el volumen final q debe ser se 200ml.
Terminada la solución se deposito en una botella color ámbar la cual se etiqueto con el nombre de la solución y se guardo en el refrigerador.
Se pesara 0.556g de Fe SO4 7H2O y 0.744g de EDTA 2H2O
El Fe SO4 7H2O se disolverá en agua solamente agitándolo para q se disuelva bien
El EDTA 2H2O se colocara en agua y se calentara a baño maría para que se disuelva bien. Se dejara enfrían unos minuto.
Después se mezclaran las soluciones agitándolas para una mezcla correcta
Cuando la solución esté terminada finalmente se depositara en una botella color ámbar y se etiquetará con el nombre de la solución y se depositara en el refrigerador.
VII. RESULTADOS
IMAGEN. 1 en esta imagen se muestran los dos reactivos que se utilizaron para preparar las soluciones de quelatos.
IMAGEN. 2 en esta imagen se muestra que el reactivo sulfato -férrico se peso adecuadamente 0.556g en la balanza.
IMAGEN. 3 en esta imagen se muestra el segundo reactivo que es EDTA igualmente se peso adecuadamente 0.744g en la balanza.
IMAGEN. 4 en esta imagen se muestra que después de a ver pesado adecuadamente el EDTA posteriormente es calentado a baño maría.
IMAGEN. 5 después de a ver calentado el EDTA por unos minutos posteriormente se mezclan bien ambas soluciones.
IMAGEN. 6 en esta imagen se muestra las soluciones ya diluidas, posteriormente estas son aforadas con agua destilada a 200 ml, una vez aforadas estas soluciones son vaciadas a una botella color ámbar y esta en introducida a un refrigerador a 4º c.
VIII. CONCLUCIONES Y RECOMENDACIONES
Para preparar soluciones stock se deben pesar con exactitud las sales necesarias para la solución, esto para que los vegetales no tengan carencia de algún nutriente y crezcan en la forma debida.
IX. FUENTES CONSULTADAS
· Trabajo de tesis de maestría. http://www.ciad.mx/boletin/sepoct02/Efecto%20de
· Encina C. L. Vitrificación de plantas cultivadas in vitro http://www.encuentros.uma.es/encuentros28/28vitrificacion.html
· Montoya, H. L. M. 1991. Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia.
· http://www.revista.unam.mx/vol.6/num11/art104a/nov_art104a.pdf
· http://www.espatentes.com/pdf/2274178_t3.pdf
· http://es.wikipedia.org/wiki/Micropropagaci%C3%B3n
X. ANEXOS
En el anaquel deben estar acomodadas todas las soluciones de una forma que facilite su manejo y no se dificulte al momento de ocuparlas, ya que es perdida de tiempo en andar buscando las soluciones ya que se encuentran desordenados.
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